羅丹明標記鬼筆環(huán)肽 常用溶液
羅丹明標記鬼筆環(huán)肽 常用溶液
鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標記組織切片，細胞培養(yǎng)物或無細胞體系中的F-actin，從而對F-actin進行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。
鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。
本品為TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。
1. 工作液準備
本品以溶于甲醇的 20µM 儲存液形式提供，總量為 300µl。按照 100 nM 的工作液濃度來換算，可制備總量為 60 ml 的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開始實 驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
2. 染色步驟
1） 細胞爬片生長 24h，使其密度達到 50%匯合度。
2） 吸掉培養(yǎng)液，37℃預熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細胞 2 次。
3） 使用溶于 PBS 的 4%甲丨醛溶液進行細胞固定，室溫固定 10min。 注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。
4） 室溫條件下，用 PBS 清洗細胞 2~3 次，每次 10min。
5） 室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5min。
6） 室溫條件下，用 PBS 清洗細胞 2~3 次，每次 10min。
7） 取 200µl 配制好的 TRITC 標記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育 30min（通常情況下， 4℃~37℃孵育皆可）。 注意：為了降低背景，可于 TRITC 標記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入 1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮 發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。
8） 用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5min。
9） 使用 200µl DAPI 溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復染，約 30s。
10) 用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫 掉多余封片劑，然后用指甲油封片。此法制備的標本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個月內(nèi)可繼續(xù)做 F-actin 染色分析。 注意：也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑合并步驟 9）10），簡化步驟。
11) 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=540/570nm）和 DAPI 激 發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。
